Лейкоциты венозной или пуповинной крови, взятие материала для ПЦР. ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора

Расходные материалы и реагенты

Вакуумная пробирка для взятия венозной крови с К2/К3 ЭДТА для гематологических исследований

Например, вакуумная пробирка «Vacuette® Premium К2 EDTA» («Greiner Bio-One GmbH», Австрия) или аналогичная

Система вакуумного забора крови

Например, система вакуумного забора крови «Vacuette®» с принадлежностями («Greiner Bio-One GmbH», Австрия) или аналогичная

Взятие

Взятие венозной крови рекомендуется производить натощак или через 3 ч после приёма пищи из локтевой вены в положении сидя. Взятие пуповинной крови осуществлять при проведении кордоцентеза.

Взятие крови произвести в пробирку с 6% ЭДТА.

Гепарин в качестве антикоагулянта использовать нельзя!

Закрытую пробирку с кровью сразу после взятия несколько раз плавно перевернуть вверх дном, чтобы кровь в пробирке с антикоагулянтом тщательно перемешалась. После плавного перемешивания пробирку поместить в штатив.

Хранение

Условия хранения и транспортировки материала

1) До проведения предварительной обработки:

при температуре 18–25 °С — в течение 2 ч;
при температуре 2–8 °С — в течение 3 сут

с момента взятия биологического материала.

Недопустимо замораживание образцов цельной крови!

2) после предварительной обработки проб (лейкоцитов крови) до ПЦР-исследования:

при температуре от –24 до –16 °С — в течение 12 мес;
при температуре не выше –68 °С — длительно.

Допускается однократное замораживание–оттаивание материала.

Предварительная обработка

Способы получения лейкоцитарной фракции крови

Способ первый. 1,5 мл цельной крови перенести в пробирку объёмом 2,0 мл, используя наконечник с фильтром. Центрифугировать 10 мин при 50 g (например, 800 об/мин для лабораторной микроцентрифуги «MiniSpin» («Eppendorf Manufacturing Corporation», Германия)). Затем 500–600 мкл супернатанта (верхний слой плазмы с лейкоцитами) перенести в другую пробирку объёмом 2,0 мл, используя наконечник с фильтром, и повторно центрифугировать 10 мин при 10 000 g (например, 12 000 об/мин для лабораторной микроцентрифуги «MiniSpin» («Eppendorf Manufacturing Corporation», Германия)). По окончании центрифугирования удалить супернатант, используя наконечник без фильтра и отсасыватель медицинский, оставив 200 мкл надосадочной жидкости и осадок. Полученную пробу использовать для экстракции НК.

Способ второй. В пробирки объёмом 1,5 мл внести 500 мкл реагента для селективного лизиса эритроцитов цельной венозной или пуповинной крови (например, реагент для предобработки цельной периферической и пуповинной крови «ГЕМОЛИТИК» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия, РУ № ФСЗ 2010/09505), или аналогичный) и 200 мкл исследуемой цельной крови, используя наконечник с фильтром. Пробирки плотно закрыть и аккуратно перемешать содержимое на вортексе (например, центрифуге/вортексе Мульти-Спин модель «MSC-3000» (SIA «Biosan», Латвия) или аналогичном). Инкубировать 3 мин при температуре 18–25 °С, затем ещё раз аккуратно перемешать на вортексе (например, центрифуге/вортексе Мульти-Спин модель «MSC-3000» (SIA «Biosan», Латвия) или аналогичном) и оставить еще на 3 мин. Перемешать на вортексе (например, центрифуге/вортексе Мульти-Спин модель «MSC-3000» (SIA «Biosan», Латвия) или аналогичном), после чего центрифугировать 2 мин при 4000 g (например, 8000 об/мин для лабораторной микроцентрифуги «Mini- Spin» («Eppendorf Manufacturing Corporation», Германия)). После центрифугирования удалить надосадочную жидкость, используя наконечник без фильтра и отсасыватель медицинский, не захватывая осадок. К полученному осадку добавить 500 мкл реагента для селективного лизиса эритроцитов цельной венозной или пуповинной крови (например, реагент для предобработки цельной периферической и пуповинной крови «ГЕМОЛИТИК» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия, РУ № ФСЗ 2010/09505, или аналогичный). Закрыть пробирки, перемешать содержимое пробирок на вортексе (например, центрифуге/вортексе Мульти-Спин модель MSC-3000 (SIA «Biosan», Латвия) или аналогичном) до полного ресуспендирования клеток. Затем инкубировать пробирки 3 мин при температуре 18–25 °С и ещё раз перемешать содержимое пробирок на вортексе (например, центрифуге/вортексе Мульти-Спин модель MSC-3000 (SIA «Biosan», Латвия) или аналогичном). После чего центрифугировать 2 мин при 4000 g (например, 8000 об/мин для лабораторной микроцентрифуги «Mini-Spin» («Eppendorf Manufacturing Corporation», Германия)). После центрифугирования удалить надосадочную жидкость, используя наконечник без фильтра и отсасыватель медицинский, не захватывая осадок.

Внимание! Лейкоцитарная фракция, полученная после предварительной обработки цельной венозной или пуповинной крови, должна быть немедленно лизирована или заморожена.

Условия хранения предварительно обработанных проб (лейкоцитов крови) до ПЦР-исследования

При температуре от –24 до –16 °С — в течение 12 мес;
при температуре не выше –68 °С — длительно.

Выявляемые патогены

Биологический материал используется для выявления нуклеиновых кислот следующих микроорганизмов

Лейкоциты венозной крови

Лейкоциты пуповинной крови

Вирусы
Human alphaherpesvirus 1	●	●
Human alphaherpesvirus 2	●	●
Human alphaherpesvirus 3	●	●
Human betaherpesvirus 5	●	●
Human betaherpesvirus 6 A/B	●
Human betaherpesvirus 7	●
Human gammaherpesvirus 4	●	●
Human immunodeficiency virus (DNA)	●
Marburg virus	●
Rubella virus		●
Sudan ebolavirus	●
Tick-borne encephalitis virus	●
West Nile virus	●

Бактерии
Anaplasma phagocytophilum	●
Bartonella spp.	●
Borrelia burgdorferi sensu lato	●
Borrelia spp.	●
Brucella spp.	●
Coxiella burnetii	●
Ehrlichia chaffeensis	●
Ehrlichia muris	●
Leptospira spp.	●
Rickettsia spp.	●
Yersinia pestis	●

Простейшие
Leishmania spp.	●
Toxoplasma gondii	●	●